2003 年畢業于中國科學院上海有機化學研究所，并獲有機化學博士學位，2003—2008年在美國哈佛大學醫學院細胞生物學系從事博士后研究。2008 年歸國后，在諾華制藥公司擔任藥物研發實驗室研究員、主任，從事表觀遺傳學靶點藥物的開發工作。于 2014 年加入中國科學院上海有機化學研究所，任“百人計劃”研究員、博士生導師、課題組組長。主要工作集中在“不可靶向”抗腫瘤靶點的小分子抑制劑開發和新型腫瘤免疫藥物的開發等，并取得了重大進展；主持和參與了科技部“重點研發計劃”、基金委“重點項目”、中科院“先導科技專項”等多項國家重大課題。研究成果作為通訊作者論文發表在 Proc Natl AcadSci USA、J Med Chem 等國際學術期刊上，并申請多項專利，部分成果已成功實現轉化。

曹恒義，朱繼東 * 

（中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉研究中心，上海 201203）

[摘要]蛋白磷酸酶是一類以蛋白質為底物使其去磷酸化的酶，與蛋白激酶的磷酸化作用剛好相反，二者共同調節生物體內各種蛋白質的磷酸化水平，在生物信號傳遞中發揮著重要的作用。最近的研究表明，一些蛋白磷酸酶的功能異常與腫瘤、糖尿病和自身免疫性疾病等都有著密切的關聯。不同于蛋白激酶的研究，目前對于蛋白磷酸酶在體內調控機制的理解尚淺，且缺乏高活性和特異性的小分子蛋白磷酸酶抑制劑作為化學探針，因此以蛋白磷酸酶為靶標開發治療藥物的研究一直進展緩慢。近年來，一系列作用于蛋白磷酸酶催化位點以外的小分子變構抑制劑逐漸被發現，為蛋白磷酸酶的研究帶來新的進展，綜述這些新的蛋白磷酸酶變構抑制劑的研究進展，重點介紹與疾病相關且作用位點明確的小分子抑制劑，簡要介紹其發現過程，以期為更多的蛋白磷酸酶變構抑制劑的研究工作帶來啟發。

生物體內的磷酸化調控是調節細胞生命活動的最重要的調控方式之一。其廣泛地發生在蛋白、磷脂、糖類和核糖核苷酸等諸多細胞成分中。蛋白激酶和蛋白磷酸酶分別作為磷酸化和去磷酸化功能的兩大類蛋白，在細胞中維系著蛋白磷酸化調控的平衡，因此對它們功能的研究顯得極為重要。蛋白質的磷酸化一般發生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上，蛋白激酶通常以 ATP 為底物將磷酸基團轉移到這些氨基酸殘基上使其磷酸化，從而調節蛋白的功能或穩定性，或者將細胞信號繼續傳遞下去，蛋白磷酸酶則會將蛋白氨基酸殘基上的磷酸水解。 

目前發現 107 個蛋白磷酸酶亞家族，可以分為如下 4 類：蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosinephosphatases，PTPs）、金屬離子依賴性蛋白磷酸酶（metal-dependent protein phosphatases，PPMs）、磷蛋白磷酸酶（phosphoprotein phosphatases，PPPs）以及鹵酸脫鹵型磷酸酶（phosphatases of the haloaciddehalogenases，HAD 磷酸酶），其中 PPMs 和 PPPs屬于蛋白絲 / 蘇氨酸磷酸酶，HAD 磷酸酶中除了缺眼蛋白家族（eyes absent family of proteins，Eya）屬于酪氨酸磷酸酶以外，其余已知的均為絲/蘇氨酸磷酸酶。PTPs 根據催化模組的不同又分為第 1、2、3 類 PTPs 以及細菌 PTPs。第 1 類 PTPs 包括受體型 PTPs、非受體型 PTPs 和雙特異性磷酸酶（dualspecificity phosphatases，DSPs），DSPs 既可以使酪氨酸去磷酸化，也可以使絲/蘇氨酸去磷酸化。

由于蛋白激酶的激活功能往往與腫瘤等疾病直接相關，因此蛋白激酶很早就被作為藥物靶點來進行研究，其抑制劑也已進入臨床應用，然而，蛋白磷酸酶抑制劑的研究相對較少。作為蛋白激酶的主要拮抗蛋白，蛋白磷酸酶一開始被簡單地認為是腫瘤抑制因子，但后來隨著研究的深入，人們發現一些蛋白磷酸酶本身可能就是致癌因子，并且一些導致蛋白磷酸酶持續激活的基因異常已被證實在腫瘤等疾病中廣泛存在，是重要的原癌基因。隨著對蛋白磷酸酶去磷酸化作用的研究繼續深入，蛋白磷酸酶抑制劑的潛在臨床治療價值得到越來越多的實驗驗證；同時，對蛋白磷酸酶活性有調節作用的小分子也為致病機制研究提供了重要的工具。早期有一些天然產物被發現具有蛋白磷酸酶抑制能力，但它們均主要在兩個方面存在一些問題而最終無法進入臨床應用：一是特異性問題，這些抑制劑多作用于磷酸酶的催化域，而同家族蛋白磷酸酶催化域高度保守，抑制劑難以區分不同亞型的磷酸酶，從而帶來潛在的副作用，并給藥理機制研究造成困難；二是蛋白磷酸酶的催化域往往帶有正電荷，更傾向于結合帶負電的分子，而帶負電荷的小分子抑制劑本身在代謝和生物利用度方面處于弱勢。最早，人們設計蛋白磷酸酶底物類似物來競爭蛋白磷酸酶的作用，但絕大多數都因成藥性差而失敗。直到最近，一些分子通過作用于蛋白磷酸酶催化域以外的潛在口袋來調節蛋白磷酸酶的活性（見表 1），巧妙地回避了蛋白磷酸酶催化域抑制劑特異性差和成藥性差的問題，這些新的蛋白磷酸酶變構抑制劑的問世為蛋白磷酸酶的研究帶來新的活力，也讓蛋白磷酸酶作為藥物靶點重獲希望。本文就目前熱門的蛋白磷酸酶變構抑制劑的研究進展作一綜述，希望為更多新的蛋白磷酸酶變構抑制劑研究帶來啟發。

1 蛋白酪氨酸磷酸酶 1B 變構抑制劑

蛋白酪氨酸磷酸酶 1B （protein-tyrosine phosphatase1B，PTP1B）是由 PTPN1 基因編碼的一種非受體蛋白酪氨酸磷酸酶（non-receptor PTP）。越來越多的證據表明，PTP1B 在多種腫瘤中都存在高表達，如前列腺癌、上皮癌、卵巢癌、乳腺癌和胃腸道癌等，因此有人將其視為能夠促進腫瘤生長的蛋白磷酸酶。更讓人感興趣的是，PTP1B具有減弱細胞對胰島素敏感性的作用，其可以使胰島素受體 b 基（insulin receptor b subunit，IRb）的 pY1162/pY1163 酪氨酸以及胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）去磷酸化從而減弱胰島素誘導的蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）磷酸化，當 PTP1B 被抑制后可恢復細胞對胰島素的敏感性，因此 PTP1B 的抑制劑有望成為治療 2 型糖尿病的新方案。此外，PTP1B 對瘦素（leptin）信號通路也有一定的作用，PTP1B 抑制劑也被開發用于肥胖癥的治療。

文獻報道的 PTP1B 抑制劑已有很多，既有天然產物也有人工合成的小分子抑制劑，它們絕大多數都作用在催化位點上，雖然在體外試驗中具有抑制活性，但在選擇性和細胞滲透性上仍然存在很大的局限性，因此開發催化位點之外的抑制劑是非常有希望突破這種局限的方案。1997 年，Puius等在催化位點附近發現了芳基磷酸結合位點，這一位點的氨基酸殘基序列相較于催化位點在同源蛋白中具有更大的差異，隨后越來越多的 Cys215 殘基附近的位點被發現，針對這些位點和催化位點設計的雙位點抑制劑成功解決了一部分蛋白磷酸酶抑制劑選擇性差的問題，但由于這些抑制劑仍然依賴催化位點的結合因而仍具有帶電荷基團或易被代謝的基團，不利于成藥。2004 年，Wiesmann 等報道了首個 PTP1B 變構抑制劑，他們通過酶動力學試驗測試了一些非磷酸結構的 PTP1B 抑制劑及衍生物，從中發現了一個不與底物相競爭的化合物 1（IC50=350 µmol·L^-1），隨后改造的化合物 2（IC50=22 µmol· L^-1）和 3（IC50 = 8 µmol· L^-1）的抑制活性提高了約 40 倍，繼而通過共晶結構發現化合物 2 結合在新的變構位點上，該位點位于 α3 螺旋和 α6 螺旋之間的凹槽，抑制劑作用于這一位點可以阻止對催化區域十分重要的WPD loop關閉構象（活性構象）的形成（見圖 1）。由于化合物 2 作用在同源性很高的催化區域之外，隨后的選擇性試驗也發現它對同源蛋白 LAR（IC50 >500 µmol·L^-1）和 TC-PTP（IC50=129 µmol·L^-1）的抑制活性與 PTP1B 存在明顯差異。細胞試驗也證實了這些化合物具有增強胰島素信號傳導的作用，這一發現極大地激發了研究人員對蛋白磷酸酶抑制劑研發的熱情。Tang 等后來在化合物 1~3 的結構基礎上進一步改造得到化合物 4（IC50=3.2 µmol·L^-1）。2014 年，Krishnan 等通過靶點篩選發現 MSI-1436（5，又名 trodusquemine）可作用于 PTP1B（對 PTP1B1-405 的 IC50 為 600 nmol·L^-1），并結合磁共振（NMR）和蛋白晶體數據分析了更長片段的 PTP1B 蛋白的變構位點的作用機制，發現 MSI-1436 可以作用在一個新的變構位點，該位點位于 C 端的 α9' 螺旋上。小鼠移植瘤模型實驗發現，MSI-1436 能抑制人表皮生長因子受體-2（humanepidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性的乳腺癌細胞生長。遺憾的是，由于 MSI-1436 活性較低且在體內的生物利用度較差，DepYmed 公司于 2017 年停止了該化合物的臨床試驗，目前，其改造后的第 2 代分子 DPM-1001（6，對 PTP1B1-405 的IC50 為 100 nmol·L^-1）正在進行臨床前研究，該分子可以與 Cu2+ 形成穩定的配合物，并且該配合物可能與 C 末端的組氨酸結合。

2 含 Src 同源 2 結構域蛋白酪氨酸磷酸酶變構 抑制劑

含 Src 同源 2 結構域蛋白酪氨酸磷酸酶（Srchomology 2 domain containing protein tyrosinephosphatase，SHP2）由 PTPN11 基因編碼，其結構包含 N 端的 2 個 Src 同源 2 結構域（N-SH2 和 C-SH2domains）和 C 端的 1 個具有催化功能的 PTP 結構域。在通常狀態下，N 端的 SH2 結構域會與 PTP 結構域相互作用形成一種自抑制的構象，當 SH2 結構域與酪氨酸磷酸化的生長因子受體結合后會解除SHP2 的自抑制構象，形成開放的活化狀態從而激活PTP 結構域的去磷酸化功能。活化的 SHP2 可以激活 RAS- 細胞外調節蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK） 信 號通路，因 此 SHP2 是諸多蛋白激酶通路上的重要調控蛋白。最近也有研究表明，SHP2 可以通過結合程序性死亡受體 1（programmed cell death protein 1，PD-1）和 B、T 淋巴細胞衰減因子（B- and T-lymphocyte attenuator，BTLA）等抑制性的免疫檢查點來調節 T 細胞的活化。同時，PTPN11 基因的突變導致 SHP2 蛋白的持續激活在多種人類發育性疾病和癌癥中都被發現，如白血、努南綜合征等，因此被認定為是原癌基因。早期針對其 PTP 結構域的抑制劑同樣存在選擇性差、活性低、成藥性差等缺點。2016年，諾華（Novartis）公司報道了化合物 SHP099（7，IC50 = 0.071 µmol· L^-1），該化合物不同于以往的 SHP2 抑制劑，共晶研究發現它能結合到 2 個SH2 結構域和 PTP 結構域三者之間（稱作“隧道”位點），使 SHP2 穩定在關閉的自抑制構象上（見圖 2），從而抑制 SHP2 的活性。這一獨特的作用方式使 SHP099 成為首個高效、可口服、選擇性好的 SHP2 抑制劑。在隨后的研究中，Fodor 等又發現了 SHP2 結構上的另一個變構位點 ——“門閂”位點，該位點位于 N-SH2 結構域和 PTP 結構域交界面之間，同樣可以穩定 SHP2 的自抑制構象（見圖 2），針對該位點篩選得到變構抑制劑 SHP244（8，對 SHP21-525 的 IC50 為 60 µmol· L^-1），其作為苗頭化合物經進一步改造后，抑制活性有所提升，但該位點的抑制劑活性相較作用于“隧道”位點的抑制劑仍然較弱，盡管如此，新的位點也具有很好的開發潛力，對未來解決可能出現的變構位點突變產生耐藥的情況有所幫助。最近，諾華公司的 SHP2 變構抑制劑開發又有了新的進展，在接連發表的 2 篇文章中，諾華公司對 SHP099 進行了進一步改造，進一步擴充了“隧道”位點變構抑制劑的化合物庫，開發了一系列活性更高、藥物代謝性質更好的化合物，目前 TNO155（9）已處于Ⅰ期臨床試驗中，這充分說明了磷酸酶的變構抑制劑具有很大的藥物開發潛力。在 SHP099 被報道之后，越來越多的研究機構和醫藥企業開始致力于 SHP2 變構抑制劑的研發，SHP2 也成為明星靶點。Xie 等在 SHP2 的“隧道”位點關鍵位置引入與疾病相關的 E76A 突變，利用 SHP2E76A 持續激活的蛋白來篩選有效的變構抑制劑，發現經過改造得到的化合物 10（對 SHP2E76A 的IC50 為 0.71 µmol·L^-1）能有效抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路。Nichols 等發現 SHP099 的類似物 RMC-4550（11，IC50 =0.58 nmol·L^-1）可以對 BRAF 第 3 類突變、神經纖維瘤蛋白 1（neurofibromin 1，NF1）缺失以及KRAS(G12C) 等依賴 GTP 激活 RAS-MAPK 通路的癌癥驅動基因產生抑制，目前 Revolution Medicines公司的 RMC-4630 也已處于Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗階段。

3 淋巴酪氨酸磷酸酶變構抑制劑

淋巴酪氨酸磷酸酶（lymphoid tyrosine phosphatase，LYP）是由 PTPN22 基因編碼的磷酸酶，催化位點中心在 Cys227，它在 T 細胞信號調節中有著重要的作用并有可能成為治療自身免疫性疾病的靶點。LYPR620W 雜合突變在 1 型糖尿病、類風濕性關節炎、格雷夫斯病以及一些自身免疫性疾病中均有發現，但是其發病機制尚不十分明確，近期的研究表明，突變的 LYP 可能導致 T 細胞整合素下游信號分子的磷酸化水平升高 。該靶點目前鮮有變構抑制劑的報道，Stanford 等報道的 LYP 抑制劑不帶有羧酸、磷酸等基團，他們通過動力學分析、多肽氨基酸氫/氘交換質譜分析[peptide amide hydrogen/deuterium exchange massspectrometry (DXMS) analysis]、分子對接（docking）以及對關鍵氨基酸殘基進行突變，發現他們的抑制劑 12（IC50 = 5.28 µmol · L^-1）作用于催化位點之外的位點，因此具有良好的選擇性。最近，Li 等發現了又一 LYP 變構抑制劑 NC1（13，Ki = 4.3μmol · L^-1），他們運用非天然氨基酸 2-氟-酪氨酸（2-fluorine-tyrosine，F2Y）替換 Leu281，并用19F-NMR 觀測 WPD loop 的運動，發現該抑制劑能限制 WPD loop 的構象。

4 白細胞共同抗原變構抑制劑 

白細胞共同抗原（leukocyte common antigen，即 CD45）是一種在白細胞膜上表達的受體蛋白酪氨酸磷酸酶，由 PTPRC 基因編碼，其功能對 T 細胞受體（T-cell receptor，TCR）的信號轉導以及 T細胞的激活至關重要，它可以調節 Src 家族蛋白激酶的淋巴細胞特異性酪氨酸蛋白激酶（lymphocytespecific protein tyrosine kinase，Lck）等，將其 pY505去磷酸化（待激活的活化態，“primed” status）從而促進 Lck pY394（小鼠 pY393）的自磷酸化激活；此外，pY394 的去磷酸化也受到高濃度 CD45的調節，因此 CD45 作為雙向調節 Lck 等蛋白活性的關鍵因子，維持著 Lck 等蛋白的磷酸化平衡，避免 Lck 持續的超活化狀態。CD45 由胞外糖基化的可變結構域、1 個單次跨膜結構域以及保守的胞內的 D1、D2 結構域組成，其中 D1 結構域具有催化磷酸基團水解的半胱氨酸殘基，D2 則不具有催化活性。當 PTPRC 基因發生改變以后，會導致可變剪接發生變化使 CD45 表達的亞型發生改變，這與多種自身免疫性疾病相關，如多發性硬化癥、系統性硬化癥、系統性紅斑狼瘡、自身免疫性肝炎等，因此 CD45 也被視為十分有價值的治療自身免疫性疾病的靶點。此外，CD45 表達水平下降也被發現在對抗埃博拉病毒和炭疽感染中具有一定的作用。Perron 等先通過虛擬篩選得到了可能作用在 D1、D2 結構域之間的化合物，從中發現了一個選擇性較好的苗頭化合物，進一步改造得到化合物 14（IC50 = 200 nmol · L^-1）并在突變試驗中驗證了其結合位點，作者推測其可能通過該變構位點影響 CD45 的構象和活性，使 Lck 的pY393 增加，活化態的 Lck 減少，阻斷 TCR 信號，遲發性過敏小鼠模型實驗表明，該化合物可減少炎癥反應。

5 絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶 3 變構抑制劑

絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶 3（mitogen-activatedprotein kinase phosphatase 3，MKP-3）又稱為 DUSP6，是一個廣泛存在的 DSP 家族的蛋白磷酸酶，除了解除酪氨酸的磷酸化，還可以對 MAPK、ERK 等的絲/蘇氨酸去磷酸化，其功能主要是負反饋調節成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）信號。MKP-3 作為 RAS-ERK 通路的抑制蛋白，其抑制劑目前主要被用于一些胚胎發育、免疫和 FGF 相關的研究。盡管如此，也有一些文獻報道 MKP-3 可能促進腫瘤的產生。目前 MKP-3 變構抑制劑很少，Molina 研究團隊通過轉基因斑馬魚構建了體內篩選模型，最終發現 MKP-3 抑制劑 BCI（15，斑馬魚 FGFR 激活試驗 EC50 為 10.6 µmol· L^-1），該抑制劑能有效抑制 ERK 介導的 MKP-3 活化，從而抑制FGF 信號，并發現其可能作用于催化位點旁的變構位點上，隨后改造的 BCI-215（16，EC50= 12.0 µmol·L^-1）相較于 BCI 有著更低的細胞毒性。2017年，Kaltenmeier 等發現 BCI-215 可以在 MDABN-231 人乳腺癌細胞中選擇性激活 MAPK 信號通路引起細胞壞死。

6 肝臟再生磷酸酶變構抑制劑

肝臟再生磷酸酶（phosphatases of regeneratingliver，PRL）主要有 PRL-1、PRL-2 和 PRL-3 等 3個亞型，分別由 PTP4A1、PTP4A2、PTP4A3 基因編碼，三者基因序列高度相似。有證據表明PRL 在促進腫瘤轉移侵襲過程中有重要的作用，并在多種腫瘤中高表達。由于 PRL 催化區十分平坦，沒有明顯的小分子結合口袋，并且與其他 PTP家族蛋白的催化區高度相似，因此給 PRL 選擇性抑制劑的設計帶來挑戰。值得慶幸的是，PRL 蛋白在細胞內需要通過相互結合形成同源三聚體才能發揮促進細胞遷移的功能，Bai 等根據這一特點，通過虛擬篩選的方法發現了作用在三聚體交界面的變構抑制劑 17，其在 10 µmol· L^-1 濃度下可抑制PRL1 過表達細胞增殖和遷移，能有效地在體外和小鼠移植瘤模型中抑制腫瘤生長；在共晶結構中，其類似物 Analog-3（18）與 PRL1 單體結合在三聚體的交界面上（見圖 3）。

7 野生型 p53 誘導磷酸酶變構抑制劑 

野生型 p53 誘導磷酸酶 1（wild-type p53-inducedphosphatase 1，Wip1）是由 PPM1D 基因編碼的絲/蘇氨酸磷酸酶，可以負向調節 DNA 損傷應答通路（DNA damage response pathway，DDR）上的關鍵蛋白，如 p53 等。當細胞因電離輻射、化療藥物而造成損傷時，細胞會啟動 DNA 損傷應答通路來減緩細胞周期，修復 DNA，或啟動細胞凋亡，從而維持基因組的穩定。當損傷修復結束后，細胞則通過蛋白磷酸酶停止 DDR，其中 PP2C 絲 / 蘇氨酸磷酸酶家族在其中發揮著重要作用，Wip1 就是由 p53誘導產生的這一類磷酸酶。目前在多種腫瘤中發現 PPM1D 基因擴增和 Wip1 過表達，因而 Wip1 抑制劑被認為能間接激活野生型 p53。 

由于 Wip1 的結構仍未完全解析出來，目前唯一報道的作用于催化位點之外的抑制劑是 GSK2830371（19，對 Wip12-420 的 IC50 為 6 nmol·L^-1）。Gilmartin等通過酶活性試驗（以熒光素二磷酸酯為底物）和酶親和力試驗（利用 DNA 編碼化合物庫），分別采用生物化學和生物物理方法得到具有相似性的CAA（capped amino acid）小分子結構，經改造后得到 GSK2830371；由于未能成功得到共晶結構，他們采用了光親和標記試驗來驗證 CAA 分子的結合位點，再結合同源蛋白 PPM1A 的結構分析，發現 CAA 分子結合在 Wip1 催化位點外的一段可翻動的“flap”片段附近，該片段對催化有著重要作用，因此該抑制劑具有很好的特異性，并且在小鼠移植瘤模型中也能有效抑制 B 細胞淋巴瘤的生長。

8 蛋白磷酸酶調節亞基 15A/15B 變構抑制劑 

蛋白磷酸酶調節亞基 15A（protein phosphatase1 regulatory subunit 15A，PPP1R15A）和蛋白磷酸酶調節亞基 15B（protein phosphatase 1 regulatorysubunit 15B，PPP1R15B）是分別由 PPP1R15A 和PPP1R15B 編碼的另一類蛋白絲/蘇氨酸磷酸酶 ——PPPs，這一亞家族的結構與 PPMs 存在明顯的差異， 由保守的催化亞 基（catalytic subunit proteinphosphatase 1，PP1c）和不同的調節亞基（如 R15A或 R15B）相結合而組成，眾多的調節亞基決定了全酶的細胞定位以及底物特異性。最早，Tsaytler等發現了 α2 腎上腺素受體激動劑胍那芐（20，guanabenz，R15A-PP1c SPR試驗：KD =0.122 μmol·L^-1）可以選擇性地結合在 PPP1R15A 上，干擾真核翻譯起始因子 2-α 亞基（eukaryotic translation initiationfactor 2 subunit alpha，eIF2-α）的去磷酸化，增加磷酸化 eIF2-α 的水平可以短暫減緩蛋白質的合成，有利于分子伴侶對蛋白質正確折疊，維持蛋白質穩態。隨后，該團隊的 Das 等進一步開發了 PPP1R15A選擇性抑制劑 sephin1（21，又名 IFB-088，KD =0.786 μmol· L^-1），并在小鼠中預防了 2 種蛋白錯誤折疊相關疾病 —— 腓骨肌萎縮癥（charcot-marietooth disease）和肌萎縮性側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis）。2018 年，Krzyzosiak 等報道了在體外構建的一種以表面等離子共振（surfaceplasmon resonance，SPR）技術為基礎的篩選平臺，使用更為完整的 PP1c-R15A/B 蛋白來測試小分子和酶之間的親和力，并篩選得到 PPP1R15B 選擇性抑制劑 raphin1（22，R15B-PP1c SPR 試驗：KD =0.033μmol· L^-1），該化合物可口服且可跨越血腦屏障，在亨廷頓舞蹈癥（Huntington’s disease）小鼠模型中證實對疾病有潛在的預防作用。

9 缺眼同源蛋白 2 變構抑制劑 

Eya 最早被發現是作為轉錄因子 Six1 的共激活因子，二者在胚胎發育和細胞增殖中有重要的作用，正常成人組織的 Eya 幾乎不表達，但在腫瘤中發現Six1 和 Eya 復合物的高表達。高表達的 Six1 和缺眼同源蛋白 2（eyes absent homolog 2，Eya2）可以增加腫瘤的侵襲性，縮短患者的生存期。目前發現的可以被 Eya 去磷酸化的蛋白有組蛋白H2AX、雌激素受體 β（estrogen receptor β，ER-β）和含 WD 重復結構域蛋白 1（WD repeat-containingprotein 1，WDR1），因此人們將 Eya 視為潛在的抗腫瘤藥物靶點基于以下幾種可能：當 DNA 受到損傷時，Eya 的磷酸酶活性可以使組蛋白 H2AX 去磷酸化，從而使細胞進行DNA修復而不進入凋亡，使用 Eya 抑制劑可能有助于增加患者對放化療的敏感性；磷酸化的 ER-β 具有一定的抑制腫瘤生長的作用，高表達 Eya 會使 ER-β 失去這一作用，Eya抑制劑可能可以恢復 ER-β 的磷酸化水平；WDR1則與細胞骨架相關，可能影響細胞的侵襲性，但具體機制尚不明確。 

Eya 是一類經典的非巰基催化的蛋白磷酸酶（non-thiol-based protein phosphatases），屬于鹵酸脫鹵酶家族，該家族通過天冬氨酸而非半胱氨酸催化去磷酸化。Krueger 等通過高通量篩選發現一類可以選擇性抑制 Eya2 的化合物，其中一些化合物在高濃度 Mg²⁺ 下仍具有非競爭性的酶動力學特征，隨后突變試驗發現化合物 MLS000544460（23，對 Eya2253-538 的 IC50 為 4.1 µmol· L-1）可能并不作用在催化位點上。最近，該團隊合成了溶解性更好的類似物 NCG00249987（24，對 Eya2253-538 的 IC50 為 3.0µmol·L^-1），并通過晶體結構驗證了其變構結合位點，占據該變構位點會導致催化位點的 β1-α1 loop（274-282）位置偏移，使得 Mg²⁺ 難以與催化位點結合（見圖 4），從而抑制 Eya2 的活性，降低腫瘤細胞的侵襲性。

10 結論和展望

隨著對蛋白磷酸酶研究的深入，人們更加深刻地認識到蛋白磷酸酶和蛋白激酶之間維系的磷酸化平衡在疾病中的重要作用，蛋白磷酸酶也不僅僅只發揮下調磷酸化信號的作用，異常的蛋白磷酸酶在不同環境下上調或下調磷酸化信號都可能導致疾病的產生。目前，蛋白激酶小分子抑制劑已有許多被批準用于臨床治療，相比之下，蛋白磷酸酶抑制劑的藥物研發進展則十分緩慢，大多數進展較快的蛋白磷酸酶抑制劑仍然處于臨床實驗階段。變構抑制劑的出現，可以避開高度保守的蛋白磷酸酶催化位點，不僅提高小分子對特定蛋白磷酸酶的選擇性，還可以減小分子的極性和電荷，提高溶解性、滲透性和生物利用度，因此為了攻克蛋白磷酸酶抑制劑 “ 不可成藥 ” 的難題，蛋白磷酸酶變構抑制劑藥物也被寄予厚望。除了本文提到的蛋白磷酸酶，仍有許多蛋白磷酸酶可能存在變構位點且尚未被充分研究，也有一些非競爭性抑制劑的作用位點尚未確證。在本文介紹的變構抑制劑中，人們采用多種方法對蛋白磷酸酶的變構位點進行開發，除了酶動力學分析和酶選擇性篩選，NMR、關鍵殘基突變試驗、分子對接（docking）以及小分子蛋白質共晶結構解析等諸多方法均有涉及，這些方法也為發現新的蛋白磷酸酶變構位點提供參考。由于開發新位點需要非常多的驗證工作，蛋白磷酸酶變構抑制劑的研究往往是機遇與挑戰并存，如同十幾年前開始研究蛋白激酶藥物一樣，對蛋白磷酸酶變構抑制劑的研究也許意味著正在打開蛋白磷酸化調控的另一個“寶箱”。