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PPS 點擊 藍字關注我們↑↑↑↑ 中科院上海藥物研究所徐華強課題組與美國溫安洛研究所Peter Jones課題組、Karsten Melcher課題組于北京時間2020年9月23日在國際頂級期刊《NATURE》在線發表了題為“Structure of nucleosome-bound DNA methyltransferases DNMT
DNA甲基化可以改變染色質結構、DNA穩定性及DNA與蛋白質等相互作用，從而控制基因表達。DNA甲基化可隨DNA的復制過程遺傳給新生的子代DNA，是一種重要的表觀遺傳機制。在染色質環境中，DNA的甲基化要比在溶液中復雜得多，核小體作為遺傳物質的組成單位，包裹在其外圍的DNA更加難以被甲基化。然而，大多數核小體結合的de novo DNA甲基轉移酶處于非激活狀態。de novo DNA 甲基化轉移酶3A和3B催化的CpG甲基化對哺乳動物的發育和細胞分化至關重要，并且常常與癌癥的發生密切相關。通過對大量正常組織（GTEx數據庫）和癌癥組織（TCGA數據庫）中不同亞型DNMT的表達分析，本研究以人類癌癥中主要的兩種DNMT亞型DNMT3A2和DNMT3B3與核小體核的相互作用為重點。目前，DNMT3A催化結構域和DNMT3L類催化結構域以及其與游離DNA的晶體結構已經解析，然而由于其局限性， DNMT與其天然底物核小體的相互作用機制并未得到闡述。
中科院上海藥物研究所徐華強課題組聯合美國溫安洛研究所Peter Jones課題組、Karsten Melcher課題組，長期致力于研究DNA 甲基化對基因表達調控的重要影響及其對人類癌癥發生發展的廣泛參與。為了揭示DNMT3A2/3B3與核小體的相互作用并了解染色體上DNA甲基化，通過四年多的不懈努力，團隊利用冷凍電鏡技術成功解析DNMT3A2/3B3和核小體復合物近原子分辨率的冷凍電鏡結構。該結構顯示，異源四聚體復合物（3B3-3A2-3A2-3B3）與分離的DNMT3A催化結構域和DNMT3L類催化結構域復合物非常相似，但是卻非對稱地和核小體相互作用。DNMT3B3類催化結構域之一錨定在核小體的酸性補丁（acidic patch）區域，其作用核心區域為DNMT3B3 740位和743位的精氨酸指（Arginine finger）。核小體酸性補丁區域與多種核小體結合蛋白都有至關重要的相互作用。然而，DNMT3A2催化結構域并不與核小體核心區域相互作用，而是隨著DNA的路徑，與一端的連接DNA（linker DNA）相互作用并催化其CpG甲基化。盡管DNMT3家族蛋白具有高度的保守性，通過DNA結合的DNMT3A2和核小體核心區域結合的DNMT3B3的結構對比，揭示了目標識別區域（TRD）結構域的開關功能。在所有具有催化活性的DNMT3亞型中，都含有對目標DNA作用至關重要的TRD結構域，雖然其在空間上阻斷了催化結構域與核小體核心區域相互作用，但是增強了DNA的結合能力。
a, 復合物結構的冷凍電鏡電子密度圖；b, 酸性補丁相互作用；c, DNMT3A2 催化結構域與連接DNA相互作用和DNMT3B3類催化結構域與核小體核心相互作用。
為了驗證酸性補丁相互作用對核小體募集的重要性，研究團隊對精氨酸指（R740和R743）進行了突變分析，并以遠離酸性補丁區域的氨基酸（K745和R749）作為對照。體外相互作用實驗（ALPHA Screen）顯示，相互作用核心區域740和743精氨酸指相反電荷的突變顯著減弱了DNMT3A2/3B3與核小體的相互作用，而非核心區域或者相同電荷的突變則如預期，結合能力沒有顯著變化。細胞內染色質結合能力實驗（chromatin association assay）也證實與酸性補丁相互作用740和743精氨酸指的突變導致與染色質的結合顯著降低。DNA甲基化陣列（Infinium MethylationEPIC BeadChip）同樣證實了DNMT3B3與核小體酸性補丁之間的相互作用對于體內DNA甲基化重建的重要性。突變體DNMT3B3恢復DNA甲基化的能力和其與染色質的結合能力密切相關。作為對照的K745和R749突變，甲基化恢復水平幾乎與野生型DNMT3B3一樣。相反，顯著降低與染色質結合的R740E和R743E突變，甲基化恢復效率低得多。有限的微球菌核酸酶消化實驗（MNase digestion）進一步證實了存在DNMT復合物的情況下，核小體的任一側都顯著增加了約10 堿基對的保護區域。這些數據強烈支持DNMT復合物的類催化結構域與酸性補丁相互作用對于核小體募集和DNA甲基化的重要性，并且與DNA的結合并不依賴于酶的活性位點CpG。
a AlphaScreen實驗測定His標記的DNMT3A2-DNMT3B3復合物與生物素標記的NCP相互作用。b. DNMT3 染色質結合實驗。c. HCT116細胞和DKO8共轉DNMT3B3細胞的CpG位點的甲基化熱圖。d. 箱形圖顯示了109,998個探針的DNA甲基化水平分布。
該項工作由2016年作為藥物所和溫安洛的交流生徐廷海（藥物所2017屆博士畢業生，目前為美國溫安洛研究所Peter Jones組、Karsten Melcher組共同博士后）在藥物所導師徐華強和溫安洛Peter Jones、Karsten Melcher的指導下開展，徐廷海為本文的唯一第一作者。參與此項工作的還有溫安洛研究所Minmin Liu博士，X. Edward Zhou博士，Gongpu Zhao博士以及南加州大學的Gangning Liang教授。中國科學院上海藥物所徐華強與美國溫安洛研究所Peter Jones，Karsten Melcher為本文的共同通訊作者。
信息來源：中科院上海藥物研究所
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本文來源：藥學進展 作者：中科院上海藥研所 免責聲明：該文章版權歸原作者所有，僅代表作者觀點，轉載目的在于傳遞更多信息，并不代表“醫藥行”認同其觀點和對其真實性負責。如涉及作品內容、版權和其他問題，請在30日內與我們聯系
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