鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma, NPC）是一種跟遺傳、環境等多因素相關的惡性腫瘤，在中國南方、東南亞等地區發病率較高[1]。由于在我國廣東地區鼻咽癌發病率遠高于全國平均水平，因此NPC也被稱為“廣東癌”[2,3]。EBV（Epstein-Barr virus）病毒感染是鼻咽癌的主要致癌因素之一，并在其發生進展過程中扮演了重要的角色[4]。前期研究多數基于整塊組織或細胞系樣本，無法精細和清晰的呈現腫瘤內部的異質性。尤其對于鼻咽癌內部腫瘤細胞、EBV和腫瘤微環境（tumour microenvironment, TME）細胞之間的相互作用，缺乏全面系統的認識。

針對此科學研究問題，來自北京大學生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）、生命科學學院白凡研究員團隊與中山大學腫瘤防治中心曾木圣/鐘茜教授團隊開展合作研究，研究團隊使用最新的單細胞轉錄組測序技術（scRNA-seq），結合大樣本基因組、轉錄組和臨床數據，以及流式檢測、多重免疫組化、免疫熒光、CCK-8、ELISPOT、小鼠移植瘤、細胞共培養等多種實驗手段，對鼻咽癌腫瘤微環境進行了全面系統的剖析研究，并鑒別出一類獨特的“上皮-免疫”雙重特征腫瘤細胞亞群。研究論文“Single-cell transcriptomic analysis defines the interplay between tumor cells, virus infection, and the microenvironment in nasopharyngeal carcinoma”于2020年9月8日，以research article形式在線發表于著名學術期刊Cell Research。

在這項研究工作中，研究人員首先利用Smart-seq2和10x Genomics兩種單細胞轉錄組技術平臺對19個EBV+ NPC患者的腫瘤樣本（其中3例有配對轉移位組織），以及7例非腫瘤患者的鼻咽組織樣本應用scRNA-seq技術，共捕獲到大約104,000個單細胞（圖1）。經過深入的生物信息學分析，研究人員在單細胞水平全面系統的描繪了腫瘤細胞、EBV、間質和免疫細胞等的轉錄組圖譜。同時，研究人員在單細胞水平揭示了NPC腫瘤內部異質性，以及原位和轉移位腫瘤組織潛在的播散關系。對EBV基因表達圖譜特征分析表明，EBV潛伏期和裂解期基因可在宿主同一腫瘤細胞內共表達。

圖1，整體實驗設計及來自26個樣本的約104,000個單細胞表達譜概況

值得注意的是，研究人員通過對腫瘤單細胞轉錄組數據應用非負矩陣因子分解（non-negative matrix factorization，NMF）方法解析其潛在的差異基因程序，鑒定出一種特殊的腫瘤細胞特異的“上皮-免疫”雙重特征，既腫瘤細胞既表達經典的上皮細胞標志物（如EpCAM），又表達一些免疫標志物（如MHC-II類分子，補體基因等）。研究人員進一步結合免疫組化和bulk-RNA數據分析，證實這種雙重特征的腫瘤細胞在鼻咽癌樣本中廣泛存在，并且跟較差的臨床預后緊密聯系。研究者通過體外細胞系和小鼠移植瘤模型等功能實驗，揭示出具有該“上皮-免疫”雙重特征的腫瘤細胞展現出較強的成瘤能力（圖2）。

圖2，單細胞水平發現鼻咽癌腫瘤細胞獨特的“上皮-免疫”雙重特征亞群，該亞群在鼻咽癌樣本中廣泛存在并與臨床較差預后相關

接下來，研究人員通過單細胞轉錄組分析，全面刻畫了鼻咽癌與非腫瘤鼻咽組織免疫微環境中的T細胞分群、轉錄狀態和免疫激活/耐受情況（圖3），以及髓系細胞分群、轉錄狀態和發育軌跡。

圖3，單細胞水平刻畫鼻咽癌與非腫瘤鼻咽組織免疫微環境中的T細胞分群、轉錄狀態和免疫激活/耐受情況

通過計算IFN-α 和IFN-γ表達分值，比較腫瘤來源與非腫瘤來源細胞的各類型細胞IFN分值差異，研究人員發現NPC腫瘤微環境中主要細胞類型都有顯著高的IFN-α 和IFN-γ分值，說明這種全局性干擾素響應上調普遍存在于NPC腫瘤微環境中。這個特征在其他腫瘤中尚未報道，可能反映了病毒感染與腫瘤細胞對腫瘤微環境的協同影響這一特質。

接下來，研究人員應用scRNA-seq數據的細胞特異性標記物，對140例未經治療的鼻咽癌原位腫瘤組織的bulk RNA-seq數據樣本進行解析，根據這些基因在腫瘤微環境中的差異表達特征，將其分為G1-G5共5組亞型。結合這些數據樣本的病例臨床信息，對它們的生存預后關系進行了組別分析比較。結果表明，該分子分型方法為NPC患者臨床預后提供了一種新的生物標記物（圖4）。

圖4，單細胞數據分析發掘新的鼻咽癌免疫微環境預后分型模型及腫瘤細胞與免疫微環境細胞互作關系分析

最后，通過單細胞腫瘤細胞-免疫微環境互作分析，研究人員意外地發現“上皮-免疫”雙重特征腫瘤細胞亞群對于免疫微環境中的T細胞存在更強的免疫抑制和調控功能。流式細胞實驗分析證實了鼻咽癌免疫微環境中表達共抑制分子受體的浸潤T細胞比例與“上皮-免疫”雙重特征腫瘤細胞存在正相關性。進一步的共培養實驗發現雙重特征腫瘤細胞具有抑制CD8+ TILs分泌IFN-γ能力，這可能是造成腫瘤浸潤T細胞耗竭的重要原因（圖5）。

圖5，“上皮-免疫”雙重特征腫瘤細胞對于T細胞具有明顯的抑制和調控功能

綜上，該研究在單細胞水平全面呈現了鼻咽癌腫瘤微環境細胞組分和EBV表達圖譜，同時解析了腫瘤細胞、EBV和TME非腫瘤細胞之間的互作關系，為研究NPC提供了很好的參考。特別是，本研究發現的“上皮-免疫”雙重特征腫瘤細胞亞群，拓展了對于腫瘤細胞表型變化的全新認識。

北京大學生物醫學前沿創新中心金善釗博士（已畢業）、博士后李若巖（現工作于英國Sanger Institute）和尉超（現工作于上海巴斯德研究所），中山大學腫瘤防治中心陳明遠教授、唐林泉副主任醫師為本文并列第一作者。中山大學腫瘤防治中心曾木圣教授、鐘茜副研究員，以及北京大學生物醫學前沿創新中心白凡研究員為本文共同通訊作者。哈佛醫學院Brigham婦女醫院Bo Zhao教授，Benjamin E. Gewurz教授，以及英國華威大學華威醫學院Lawrence S. Young教授為本研究提供了重要指導。該研究項目同時得到了國家重點研發計劃、國家科技重大專項、國家自然科學基金、廣東省重點研發項目，以及廣東省自然科學基金等的支持。

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