8月7日，Nature communications（《自然-通訊》，IF=12.12）在線發表了武漢大學劉天罡課題組，日本東京大學Ikuro Abe課題組以及美國賓夕法尼亞大學David Christianson課題組有關萜類合酶新功能的重要發現。論文題目為“Discovery of the cryptic function of terpene cyclases as aromatic prenyltransferases”。東京大學博士生何海兵、武漢大學卞光凱博士，賓夕法尼亞大學博士生Corey Herbst-Gervasoni為本文共同第一作者；David Christianson教授，Ikuro Abe教授和劉天罡教授為該論文的共同通訊作者。該研究工作得到國家重點研發計劃合成生物學專項、國家自然科學基金、湖北省杰出青年基金的大力支持。

萜類化合物是自然界中種類最為豐富且具有眾多顯著生物活性的一類天然產物，廣為人知的青蒿素、紫杉醇、人參皂苷等是這一類產物的杰出代表。作為萜類化合物通用底物，異戊烯基焦磷酸能夠被與之相匹配的萜類合酶催化，形成復雜萜類核心骨架。此外，異戊烯基焦磷酸還可以作為UbiA型以及ABBA型芳香族異戊烯基轉移酶的底物，合成異戊烯化的芳香族產物。萜類合酶和芳香族異戊烯基轉移酶都被認為是多功能酶，具有底物以及產物雜泛性，是產物結構和功能多樣性的基礎。然而，迄今為止，還沒有證據表明這兩類酶的生物學功能存在著交集。

在該研究工作中，劉天罡，Ikuro Abe以及David Christianson教授帶領團隊分工合作，首次報道發現除了合成萜類化合物外，萜類合酶還扮演著不為人知的芳香族異戊烯基轉移酶的角色。在前期研究工作中，劉天罡教授課題組成功地在大腸桿菌、釀酒酵母等微生物體內搭建了萜類前體高效供給底盤（Biotechnology & Bioengineering，2014，通訊作者），并開發了基于該底盤的萜類產物高效挖掘策略，顛覆傳統的天然產物挖掘方式，實現了一系列萜類新骨架的高效挖掘和機理解析（Metabolic Engineering，2017，通訊作者；Current Opinion in Biotechnology，2017，通訊作者；Organic Letters，2018，通訊作者；Angewandte Chemie，2018，共同通訊作者；JACS，2020，共同通訊作者）。借助前期搭建的大腸桿菌萜類前體高效供給底盤，快速鑒定了AaTPS生物學功能以及與之對應的倍半萜骨架。此外，由于強大的底物供給能力充分釋放該酶的產物合成潛力，劉天罡課題組在含有AaTPS菌株的發酵產物中意外地發現并鑒定了一系列含量較低的異戊烯基吲哚（prenylindole）類產物。隨后通過體外反應和酶促動力學實驗證實了萜類合酶AaTPS具有芳香族異戊烯基轉移酶的功能。而且發現其活性偏好受pH值影響，在中性pH值條件下主要發揮萜類合酶功能，而在堿性環境下能夠以多種芳香族化合物和DMAPP為底物合成異戊烯基芳香族產物。受此啟發，劉天罡課題組進一步通過體外反應驗證了這種芳香族異戊烯基轉移酶功能廣泛存在于真菌來源（FgGS，FgFS，CgDS等）和植物來源（TXS，紫杉二烯合酶）的I型萜類合酶中，證明了該功能的普遍性。

為了深度解析這些雙功能酶的催化機理，Ikuro Abe教授和David Christianson教授課題組分別對倍半萜合酶AaTPS和二萜合酶FgGS進行酶動力學和結構生物學研究。證實了I型萜類合酶是雙功能酶，它們能夠在同一活性位點催化合成萜類和異戊烯基芳香族產物。并且基于結構生物學研究結果，解析了萜類合酶催化芳香族底物烯丙基化的機理：首先，芳香族底物進入活性腔導致活性位點封閉，以保護碳正離子中間體免于被大量溶劑過早淬滅。隨后，金屬離子與DMAPP之間形成配位鍵從而引發DMAPP離子化，產生烯丙基碳正離子和Mg2+3-PPi復合體。緊接著，烯丙基碳正離子烷基化相鄰的雜環芳香族底物的吲哚環，形成C-C或C-N鍵。最終，PPi獲取吲哚碳正離子中間體的酸性質子，生異戊烯基吲哚終產物（圖1）。

圖1. I型萜類合酶的芳香族異戊烯基轉移酶功能

植物萜類天然產物在微生物中的高效合成一直是代謝工程和合成生物學的熱點和難點，萜類產物的產量（如紫杉醇核心骨架紫杉二烯）與吲哚的含量呈負相關性，然而其深層次的機理一直不為人知（Science, 2010）。為了揭示這一懸而未決的問題，作者系統地研究了大腸桿菌工程菌中吲哚，異戊二烯前體以及產物三者之間的濃度關系。證實了吲哚濃度與類異戊二烯前體濃度呈正相關，而與萜類產物濃度呈負相關。為此，作者提出本研究新發新的芳香族異戊烯基轉移酶活性可作為細胞的一種內源性調節機制，在特定情況下減輕因異戊二烯底物過量積累而對細胞產生的毒性。

在本研究中，基于劉天罡課題組開發的萜類前體高效供給底盤，聯合團隊充分地展示了萜類合酶的生物合成潛力，挖掘并證實了隱藏已久的萜類合酶的芳香族異戊烯基轉移酶功能。隨后通過一系列實驗證明了其普遍性、深層次的酶催化機理以及潛在的生物學意義，進一步加深我們對萜類合酶的認知。該研究向我們進一步展示了微生物高產底盤在天然產物挖掘領域的顯著優勢與強大的應用潛力。此外，值得我們思考的是，自然界中其它種類的酶是否也蘊藏著一系列不為我們所知的新的生物學功能呢？

文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-17642-2.

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