2021年7月，美國基因療法公司Adverum Biotechnologies Inc.（NASDAQ:ADVM，Adverum）暫停了其AAV基因治療藥物ADVM-022用于治療糖尿病性視網膜病變黃斑水腫（DME）的II期臨床試驗，原因是一例受試者在接受單次高劑量治療30周后，出現了眼壓過低、炎癥以及失明等嚴重不良反應，引發了業界對該藥物安全性的擔憂。

ADVM-022是一種使用Adverum專有載體衣殼AAV2.7m8的基因療法。該療法通過眼部單次玻璃體內 (IVT) 注射進行，旨在使視網膜內細胞持續產生長久的治療和預防的效力，減輕頻繁注射抗VEGF抗體藥物的負擔，最終改善患者視力。

盡管面對臨床安全挑戰，基因療法仍然具有不可比擬的治療優勢，尤其是對于缺少替代療法的單基因遺傳疾病來說。因為該療法能從根本上補充或修復缺陷基因，恢復健康基因的正常生物學功能，在患者中最大限度地減少甚至消除影響一生的癥狀。

近五年，眼部基因療法臨床試驗也在迅速增加，針對多種罕見遺傳性視網膜疾病和基因突變角膜疾病，比如無脈絡膜血癥、Leber遺傳性視神經病變、Stargardt 病、X連鎖視網膜劈裂和X連鎖視網膜色素變性等。更值得期待的是，基因治療為遭受如AMD（老年性黃斑病變）等常見眼部疾病的病人（數億人）帶來希望。因為常規的VEGF抗體注射療法需要長期頻繁和定期的玻璃體內注射，嚴重降低了患者依從性，也增加了治療風險。而基因療法正在成為其行之有效的治療方案。

正在進行的遺傳性視網膜疾病基因治療臨床試驗（部分），圖源：Paul Yang，AAO 2020

重組AAV基因載體（rAAV）治療眼部疾病的優勢

在基因治療中，病毒載體技術是目前主要的基因導入方式，該技術的進步很大程度上驅動著基因治療領域的發展。近二十年來，腺相關病毒 (AAV) 載體掀起了該領域的臨床熱潮。

AAV是一種小型無包膜細小病毒，作為遞送系統具有許多優勢，比如無致病性、高效持續表達、易于操作以及免疫原性低等。AAV載體攜帶的治療基因（gene of interest，GOI）進入細胞后，將轉錄翻譯為功能蛋白，達到治療一系列疾病的目的。

使用AAV進行基因治療的一系列疾病。圖源：參考文獻1

rAAV是眼部基因治療的主要載體，在治療性基因遞送中，AAV單鏈脫氧核糖核酸（ssDNA）基因組中編碼調節蛋白(Rep)和結構蛋白 (cap)脫氧核糖核酸（DNA）序列被所需的GOI表達盒所替換，稱為重組AAV (rAAV)。AAV外衣殼（capsid）可以幫助GOI靶向特定組織，迄今已在靈長類動物中鑒定出12種不同的AAV血清型，它們的衣殼成分不同，顯示出不同的細胞趨向性、轉導效率和免疫原性。血清型AAV1、2、4、5、6、7、8 和 9 都顯示出視網膜組織的趨向性。

AAV治療載體結構示意圖。圖源：catapult.org.uk

在治療眼疾方面，基因療法有顯著優勢，這是由眼疾的遺傳基礎和眼部隔室的獨特性所決定的。

由于眼睛的解剖結構明確，物理空間封閉有限，這為局部給藥提供了獨特優勢。血眼屏障有助于眼部免疫特權，針對基因治療產品的免疫反應有限。而且，眼睛的視網膜細胞不再進行分裂，可允許持續的基因表達且不會整合入基因組。最主要的是一系列眼部疾?。òㄟz傳性失明）的潛在遺傳因素已被鑒定出來。此外，近來相關動物模型的開發也讓眼科研究取得重大進展，有利于開展眼部基因治療試驗。

AAV2病毒載體將治療基因通過視網膜下導入眼部。圖源：https://luxturnahcp.com/

Spark Therapeutics公司的Luxturna?（voretigene neparvovec-rzyl）是首個獲批上市的用于治療眼部罕見病的基因治療產品，Luxturna能將RPE65基因的正?？截愞D導入視網膜色素細胞 （RPE），治療雙等位基因RPE65突變的Leber 先天性黑蒙（LCA2）。

Luxturna的獲批是眼部疾病基因療法發展的重要里程碑。該項目的成功驗證了基因療法概念的可行性，也證實其在恢復或保持視力方面的重要價值。

rAAV眼部基因治療的技術瓶頸和相應解決方案

rAAV產品已顯示出作為基因治療藥物的廣闊應用前景，目前全球已有超過200項基于rAAV的臨床試驗。然而，多項在研項目并不像在LCA2 患者中觀察到的那樣始終如一地轉化為臨床結果。

事實上，作為一種由病毒基因組和多種結構蛋白組成的復雜生物制劑，rAAV產品的上游開發以及下游生產過程都面臨著許多技術挑戰。如何保證rAAV的活性功效并降低臨床使用劑量，是需要解決的關鍵問題。因此，在優化生產純化的同時，設計改造AAV載體以提高rAAV產品與靶細胞的親和力，增強GOI效力也非常重要。

AAV 產品的上游生產過程

AAV產品的下游生產過程。圖源：biovian.com

1、優化衣殼設計，改進載體工具

當所用載體的靶向和轉導能力有限，就不得不增加使用劑量以達到預期的臨床效果，但高劑量的病毒樣產品也代表混有更多的雜質，增加誘發免疫反應的風險。同時，高劑量藥物難以均衡轉導，不同細胞類型的轉基因表達水平也難以控制。

為了提高載體靶向性和特定細胞類型的轉導能力，一方面，工程化改造AAV衣殼是優化遞送載體的關鍵領域。AAV產品的衣殼質量和視網膜細胞趨向性是實現安全有效的眼部基因治療的重要特征。人們可以從天然分離株中提取AAV衣殼，也可通過合理設計、定向進化或計算機引導技術對衣殼進行改造。在UC Berkeley就職的教授David Schaffer是使用“直接進化”的先行者，其實驗室產生了現在應用于Adverum公司ADVM-022的視網膜特性性的AAV2.7m8新型載體。同時他也是4DMT公司的科學創始人，4DMT現在使用直接進化的手段發現新型的AAV載體，并在多種疾病領域進行了基因治療的布局和開發，包括，眼科，心血管疾病，及呼吸系統疾病。

值得關注的是，AAV衣殼工程化技術也是華人科學家劉勝江和陳海峰聯合創立的Avirmax公司的研發重點。據官網介紹，Avirmax擁有獨特的AAV衣殼工程技術，其開發的rAAV與受體的結合更強，能夠穿透玻璃體內限制膜（Inner limiting membrane, ILM），將GOI高效導入視網膜細胞，產生高于野生型AAV衣殼成百上千倍的濃度。Avirmax的rAVV產品可用于常見視網膜疾病，比如wAMD、DME、PCV以及十余種罕見視網膜疾病的治療。下圖是Avirmax的一種改造過的AAV衣殼的計算機模擬圖。

經工程改造的AAV-VP1衣殼蛋白

為了增加rAAV功效，人們還可以借助于基因工程和優化等技術，增強AAV載體GOI的表達水平，以達到降低藥物使用量的目的。Avirmax公司正在使用這類轉基因增強表達技術，他們的數據顯示，該技術能夠顯著增強AAV治療載體中的GOI的表達（提高10倍）。

2、降低免疫原性，實現大規模生產

AAV基因治療產品面臨的另一項挑戰是如何實現無雜質載體生產的可擴展性和經濟性。

AAV產品中的衣殼成分、載體基因組、轉基因產物或混雜污染物都有激活宿主免疫反應的可能，導致治療失敗或炎癥失控。即使AAV載體具有相對的免疫特權，但仍然能在視網膜下空間引發細胞反應。因此，AAV產品制造商必須改進生產技術，更好地純化產品并嚴格質控。其產品具有低免疫原性。

理想的AAV生產系統需在確保足夠的病毒滴度的同時減少有害污染物，去除空殼或者錯誤DNA包裝的載體，盡可能地減少臨床風險。然而，目前還沒有從載體產品中去除錯誤DNA包裝的技術；如何在大規模生產時從產品中去除空殼也是一大難題。

事實上，大規模生產AAV產品是保證臨床需求和降低產品價格的關鍵一環。從目前的應用系統來看，相比于三重轉染HEK293系統或者哺乳動物穩定細胞系生產系統，Avirmax公司使用的桿狀病毒生產平臺具有顯著優勢，是非常有吸引力的一種大規模臨床級載體生產策略。

該平臺利用昆蟲（草地夜蛾）細胞系 Sf9與兩種桿狀病毒表達載體共感染：一種桿狀病毒載體攜帶GOI及其在 ITR 區域之間的啟動子，另一種桿狀病毒載體編碼rep和cap基因。這個系統可快速生產高質量和高滴度的AAV產品，降低宿主細胞DNA錯誤包裝，提供可靠的病原體安全保證，而且，在此基礎上可以較易實現產品的大規模生產。

Avirmax的Sf9-AAV 大規模生產平臺。圖源：Avirmax官網

3、選擇合適疾病模型

之前的研究表明，使用小型模式動物的AVV實驗在轉到大型模式動物之后，其轉染效率等結果出現了偏差。而且，一些模式動物中觀察到的效果難以在人體試驗中應用和重現。由于新型AAV載體的這種不可預見性，有必要在開展AAV產品的臨床試驗之前使用大型模式動物，比如非人類靈長類動物模型（如食蟹猴或恒河猴）進行研究。據了解，Avirmax公司堅持盡早使用大動物體系，來驗證新型AAV載體的臨床轉化成功率。

除了模型物種的選擇，研究者還需要考慮選用模型的年齡，治療方式，以及跟進時間長短等因素。通過選擇更合適的體外疾病模型，可靠地模擬人類生理水平，以得出更安全有效的臨床劑量范圍。

4、克服預存免疫力，擴大患者適用人群

人類血清學研究顯示，由于之前接觸過野生型AAV，全球人群存在AAV中和抗體的流行率很高，大約67%的人有針對AAV1的抗體，72%有針對AAV2的抗體，40%有針對AAV血清型5至9的抗體。因此，AAV基因治療試驗首先需對受試者進行篩選，50%以上的患者可能會被排除試驗。此外，載體預存免疫原性也是AAV產品再給藥的主要挑戰，這一問題在體內基因治療方面尤其突出。

為了讓更多的患者得到治療機會，開發能夠“逃避”中和抗體的AAV衣殼是解決辦法之一。最近，一種新興的方法引發了關注，為解決該問題提供了新思路。該方法利用的是在細菌中發現的酶（imlifidase），目前正在測試的有IdeS和IdeZ。這類酶可在使用AAV產品之前使用，它們能在短期內降解血液中預存的抗AAV中和抗體，為AAV載體到達目的細胞創造一個臨時的時間窗口。

用酶法降解預存AAV中和抗體，以增加轉導率。圖源：參考文獻9

臨床試驗與審批的機遇和挑戰

總之，基因治療獲得成功的關鍵是在可控炎癥的劑量下保證足夠的GOI表達水平，否則就會導致療效降低或喪失，需重新給藥或引起局部組織損傷，甚至威脅生命。

基因治療的潛力剛剛開始顯現。作為一種新的治療方式，AAV基因治療仍處于發展早期階段。相較于其他積累了大量經驗和知識的生物制品（比如治療性抗體、重組蛋白），人們對AAV病毒載體的生物學特征的理解尚有待加深。

就目前的研發市場來看，專注于眼部疾病基因治療的公司越來越多。然而，我們看到很多研發項目都是集中在管線沖刺上，真正在解決基礎科學問題方面的研發力度遠遠不夠。即使有些產品沖進臨床階段，也可能會遭遇各種安全效力的問題，造成無法挽回的后果。

針對這一問題，除了加強產品基礎研發的力度和深度，不斷完善與跟進的臨床監管也同樣重要，以明確和規范基因治療產品的臨床期望。

● 2008年4月，FDA首次發布人類基因治療指南。同年7月，FDA公布關于人類基因治療的更新指導文件草案，概述了當前的監管觀點；

● 2020年1月, FDA發布了視網膜疾病基因治療指南《Human Gene Therapy for Retinal Disorders》；

● 2021年9月30日，FDA發布了《行業指南草案：早期臨床研究中單一疾病多版本細胞或基因治療產品的研究（Studying Multiple Versions of a Cellular or Gene Therapy Product in an Early-Phase Clinical Trial：Draft Guidance for Industry》(詳見參考文獻10)。在這項最新指南中，FDA創新地提出了對某一疾病的IND中，可用多個不同版本細胞和基因產品進行臨床，并對有意實施這種臨床研究初步安全性和生物活性的評估提供了多項建議，包括如何組織和構建 IND、提交新信息和報告不良事件（Adverse effect, AE）。該草案正在行業內征求反饋意見，這一新指南草案一旦定案成文，為未來細胞和基因治療產品的早期開發速度和效率的提高有很大幫助。

盡管AAV基因治療仍存在很多挑戰和局限，但現有的臨床數據表明AAV基因治療仍是一種安全、耐受性好和有效的方式。比如本文開頭提到的ADVM-022治療DME的試驗中發現存在高劑量毒性，但在低劑量試驗中沒有發現不良事件，而且ADVM-022的另一項治療濕性AMD的臨床試驗顯示，低劑量與高劑量應用患者中均未觀察到類似不良事件，這些患者的隨訪已達到治療后52周至2.5年。

在全世界范圍內，rAAV占總基因治療產品的24%，在2015-2020年之間，FDA已收到99個rAAV基因治療的IND。隨著各項技術的進步和臨床監管的完善，我們期待更多的基因治療產品上市，惠及更多的常見眼部疾病患者，帶來長久的治療益處。

參考資料：

1. Jerry R. Mendell, et al., Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Molecular Therapy(2021)29:464-488.

2. Allison M. Keeler and Terence R. Recombinant Adeno-Associated Virus Gene Therapy in Light of Luxturna (and Zolgensma and Glybera): Where Are We, and How Did We Get Here? Flotte Annual Review of Virology (2019) 6:601-621.

3. Kuzmin DA, et al., The clinical landscape for AAV gene therapies. Nat Rev Drug Discov (2021) 20:173-174.

4. Beginner’s guide to the production of AAV vectors for gene therapy–Mentored by a CDMO.https://biovian.com/beginners-guide-to-the-production-of-aav-vectors-for-gene-therapy-mentored-by-a-cdmo/

5. Mark White. Addressing the Top Five Challenges to AAV-Based Gene Therapy with ddPCR.https://www.genengnews.com/insights/addressing-the-top-five-challenges-to-aav-based-gene-therapy-with-ddpcr/

6. Christine Kay. AAV Gene Therapy Trials To Watch. July/August 2021. https://retinatoday.com/articles/2021-july-aug/aav-gene-therapy-trials-to-watch

7. Bulcha, J.T., Wang, Y., Ma, H. et al. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Sig Transduct Target Ther (2021) 6, 53.

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9. Zachary C. Elmore, Daniel K. Oh, et al.Rescuing AAV gene transfer from neutralizing antibodies with an IgG-degrading enzyme. JCI Insight. (2020) 5:e139881.

10. US Food and Drug Administration, HHS 【Docket FDA-2021-D-0776】 Studying Multiple Versions of a Cellular or Gene Therapy Product in an Early-Phase Clinical Trial：Draft Guidance for Industry, Availability.